暨南大学油料生物炼制与营养创新团队博士研究生邹硕在Bioresource Technology期刊(中科院JCR 1区,影响因子9.7)发表题为“Candida antartica lipase-catalyzed esterification for efficient partial acylglycerol synthesis in solvent-free system: Substrate selectivity, molecular modelling and optimization”的研究论文,由张震副教授指导并作为通讯作者。
一、研究背景
酯化反应通过控制原料,可以有针对性地制备高纯度和特定脂肪酸的部分甘油酯,是一种富集含有理想脂肪酸的部分甘油酯的理想方法。脂肪酶的选择性(包括底物选择性、立体特异性和区域特异性等)使其在将基本脂质资源转化为高价值和功能性脂质方面具有前景。如果能明确脂肪酶的选择性及其影响因素,就能最大限度地发挥脂肪酶的合成潜力。
来源于Candida antarctica的脂肪酶B(CALB)及其固定化形式是商业上应用最广泛的脂肪酶之一。它已被用于多个领域,包括油脂改性、生物柴油生产、聚合物生产和非特异性反应等。一些研究人员对其脂肪酸选择模式进行了研究,但大多数研究是在有机溶剂系统中进行的,或比较不同固定化载体的效果。只有少数研究探讨了甘油作为共底物的酶促酯化反应。值得注意的是,甘油和脂肪酸作为底物的酶促酯化反应是一个三步过程。脂肪酸依次在甘油骨架上酰化,依次形成甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。为了获得理想的产物组成,研究CALB的底物选择性及其对反应过程的影响是至关重要的。
二、研究方法
本研究的目的是:(i) 评估脂肪酶CALB在无溶剂酶促酯化反应中对酰基供体和羟基供体的选择性;(ii) 研究底物选择性与底物结构及反应速率间的关系;(iii) 分子对接揭示脂肪酶与底物(包括酰基供体和羟基供体)的相互作用机制;(iv) 探讨其他操作变量(底物比例、反应温度和酶用量)对产物组成的影响。
三、研究结果
脂肪酸(作为酰基供体)是酶促反应的重要底物,其碳链长度和饱和度的变化会在不同程度上调节酶的构象,从而改变选择性,导致产品组成比例的变化。文章首先研究了脂肪酸碳链长度和饱和度与初始速率之间的关系。发现碳链长度与初始速率之间的存在显著的负相关关系(R = -0.9869, p < 0.05)。
饱和度与初始速率之间存在显著正相关关系(R=0.9943,p < 0.1)。这可能与脂肪酶酰基结合位点的结构以及脂肪酸自身的物理状态等两方面因素有关。
图1 (A)脂肪酶对不同酰基供体的竞争因子;(B) (a)不同链长和(b)不同饱和度的酰基供体的酶促酯化过程;(C)不同酰基供体的酶促酯化初始速率(a),以及(b)链长和(c)饱和度与酯化反应初始速率之间的相关性
比较脂肪酶对不同的羟基供体(甘油、甘油一酯和甘油二酯)的选择性,发现甘油骨架上酰基化脂肪酸链的数量和位置主要通过影响羟基供体的空间位阻,从而影响酶的选择性。
图2 (A)不同羟基供体对酯化反应的影响。(B) MAG(a)和 DAG(b)中不同羟基位置对酯化反应的影响
为探索底物与脂肪酶的结合亲和力对酶活性的影响,进行了分子对接模拟以揭示脂肪酶与底物之间的相互作用。脂肪酶与酰基供体的分子对接结果表明,脂肪酸主要通过氢键和疏水作用与脂肪酶的氨基酸残基结合。通过以下步骤模拟酰基-酶复合物与羟基供体间的结合途径:1)脂肪酸与脂肪酶对接;2)羟基供体与酰基-酶复合物对接。结果表明酰基-酶复合物-甘油间形成了四个氢键,酰基-酶复合物-甘油一酯形成了两个氢键。酰基-酶复合物-甘油二酯间没有形成任何氢键,主要依赖于疏水作用来维持稳定性。
图3 (A) (a)脂肪酶CALB(PDB 1TCA)晶体结构中检测到的催化通道。脂肪酶与C8:0 (b)、C12:0 (c)、C14:0 (d)、C16:0 (e)、C18:0 (f)、C18:1 (g) 和 C18:2 (h)复合物的三维和二维结构。(B)脂肪酶与甘油(a)、单辛酸甘油酯(b)和二辛酸甘油酯(c)复合物的三维和二维结构。在三维图中,氢键相互作用以蓝色虚线表示。
四、研究结论
本研究探讨了脂肪酶CALB在无溶剂酯化反应中的选择性及其对产物组成的影响。研究表明,随着碳链长度的增加,脂肪酶对饱和脂肪酸的选择性逐渐降低,而对不饱和脂肪酸的选择性增强。同时,研究突出了羟基供体对酯化过程的影响,脂肪酶表现出对甘油>甘油一酯>甘油二酯的选择性顺序。分子对接验证了这些发现,并深入探讨了脂肪酶与底物之间的相互作用。本研究将有助于改善基础脂质资源的利用方式。
本研究工作得到国家自然科学基金(32272341),广东省重点领域研发计划(2022B0202010003)的支持。
原文文献:
Zou shuo, Chen Jiena, Lee Yee-Ying, Wang Yong, Zhang Zhen. (2024). Candida antartica lipase-catalyzed esterification for efficient partial acylglycerol synthesis in solvent-free system: Substrate selectivity, molecular modelling and optimization. Bioresource Technology. 412,131368.
作者简介:
邹硕,女,暨南大学生物医学物理与生物医学信息技术博士研究生,研究方向为油脂生物炼制与营养。目前已在脂质分析检测、结构脂质的定向设计与功能开发、乳液高效递送体系构建等领域开展研究,目前以第一作者身份在Bioresource Technology、Food Chemistry、Industrial Crops & Products等期刊上发表SCI论文4篇。
张震,博士/副教授,暨南大学食品科学与工程系副主任,入选“暨南英才计划”暨南杰青(第一层次),《中国油脂》, 《Journal of Future Foods》和《Grain & Oil Science and Technology》青年编委,长期从事油脂改性加工与应用基础及其产业化研究。在 Bioresource Technology、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Chemistry 和 Industrial Crops and Products 等期刊以第一/通讯作者发表论文50余篇;申请发明专利30余件,授权10余件;主持国家自然科学基金项目2项,省部级科研项目6项,承担校企横向课题8项;起草(排名第二)团体标准2项;主编或参编出版包括《甘油二酯油与人体健康》、《食品脂类学》 等在内的编著3部。